Генная инженерия: клонирование генов

Клонирование генов – это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- и эукариотических. Эти клетки, содержащие нужный ген, можно использовать для получения: а) большого количества белка, кодируемого данным геном; б) большого количества самого гена в высокоочищенном виде.

Процесс клонирования генов включает в себя несколько стадий:

1. Получение необходимого гена:

а) путем расщепления геномной ДНК с помощью рестриктаз (эндонуклеазы, расщепляющие молекулу ДНК в строго определенном месте);

б) путем химического синтеза только небольших фрагментов ДНК (так как зная последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле, можно всегда определить последовательность нуклеотидов в фрагменте ДНК, кодирующем данный белок, в соответствии с генетическим кодом). Так, путем химического синтеза был …
получен ген, ответственный за синтез соматостатина;

в) из клеток организма выделяют молекулы иРНК и с помощью фермента обратной транскриптазы (РНК-зависимая ДНК-по-лимераза) снимают ДНК-копии необходимого гена. Например, из островных клеток поджелудочной железы были выделены иРНК, несущие информацию о синтезе инсулина. А из клеток, инфицированных вирусами, выделены и РНК, несущие информацию о синтезе интерферона.

2. Ввод выделенного или полученного фрагмента ДНК в состав векторной молекулы ДНК – получение рекомбинантной ДНК. Вектор – это нечто вроде молекулярного «такси», способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она могла там реплицироваться. Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды (чаще ответственные за устойчивость к двум и более антибиотикам) и умеренные дефектные (способные к осуществлению трансдукции) бактериофаги.

Плазмиду расщепляют с помощью рестриктазы в сторого определенном месте. После расщепления ее концы, как и концы выделенной для клонирования ДНК, с помощью концевой трансферазы «доращивают» так, чтобы концевые участки плазмиды были комплементарны встраиваемой ДНК (или еще говорят «липкими»). Далее, благодаря взаимодействию «липких» последовательностей и с помощью специальных ферментов ДНК-лигаз осуществляют сшивку (лигирование) ДНК-вставки и плазмидной ДНК. Полученная в результате новая кольцевая молекула ДНК называется уже рекомбинантной ДНК.

3. Ввод рекомбинантной ДНК в состав клетки-реципиента. Клетки, выбранные для клонирования генов могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их культивирование не представляет большой проблемы (E. coli, В. subtilis и др.). Но если ген выделен по методике 1, то его необходимо клонировать в клетках эукариотов, например, дрожжей. Ввод рекомбинантной ДНК осуществляют путем трансформации (проницаемость клеточной стенки бактерий увеличивается в разбавленном растворе хлористого кальция) или трансдукции (в случае использования в качестве вектора бактериофага).

4. Отбор трансформированных бактерий. Поскольку не все бактериальные клетки в реакционной смеси будут трансформированы, необходимо произвести отбор клеток, содержащих рекомбинантные бактерии. Отбор обычно основан на том, что плазмиды обеспечивают резистентность к тем или иным антибиотикам, а следовательно, бактерии, содержащие плазмиды, будут размножаться в присутствии соответствующего антибиотика.

5. Культивирование трансформированных клеток. Культивирование отобранных клеток необходимо для наращивания биомассы с целью амплификации генов в клетках-реципиентах.

6. Выделение белкового продукта гена или выделение встроенной ДНК из очищенных плазмид.